本文摘要：摘 要：生物修復技術是一種成本較低且環境友好的可持續發展修復技術，但是其所需的修復時間較長。采用化學氧化強化生物堆修復石油污染土壤的方法探究其修復效果并采用BIOLOG ECO板和高通量測序技術探明微生物群落的響應機制。結果表明，通過240 d的生物堆修復，生物修
摘 要：生物修復技術是一種成本較低且環境友好的可持續發展修復技術，但是其所需的修復時間較長。采用化學氧化強化生物堆修復石油污染土壤的方法探究其修復效果并采用BIOLOG ECO板和高通量測序技術探明微生物群落的響應機制。結果表明，通過240 d的生物堆修復，生物修復(NP)和氧化劑強化生物修復(NP_O)處理使土壤中總石油烴從30649mg·g–1分別下降至5889mg·g–1和2351mg·g–1，化學氧化強化生物修復后的土壤石油烴濃度低于國家風險管制值(GB 36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量測序結果進一步表明，氧化劑處理的土壤中微生物活性迅速恢復，且化學氧化強化生物修復處理中具有石油烴降解潛力的菌屬Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是該處理的主要細菌標記物。
關鍵詞：石油污染土壤;化學氧化;生物修復;16s rDNA;細菌群落
石油作為重要的能源化工原料，在其開采、運輸、加工和使用過程中進入土壤環境，造成嚴重的土壤污染[1]。石油進入土壤后，會破壞土壤結構，降低氮磷等有效土壤養分。石油烴作為石油中的主要污染物，主要包括烷烴和芳香烴。這些污染物可通過揮發或食物鏈富集等途徑進入生物體內，對生態環境和人類健康構成嚴重威脅，因此，石油污染土壤亟待修復。常用的石油污染土壤修復方法主要包括物理、化學和生物修復。其中生物修復是一種修復成本較低且環境友好的可持續修復技術[2]。該技術利用微生物代謝，達到降解污染物的目標[3]。
但生物修復后期難降解污染物，如高環芳烴、長鏈烷烴等及有毒含氧中間產物會抑制微生物活性，影響微生物代謝，從而降低修復效率[3-4]�；瘜W氧化修復是利用化學氧化劑(如芬頓試劑、高錳酸鉀、過硫酸鈉等)快速降解污染物的技術方法[5]。化學氧化劑在對總石油烴(total petroleum hydrocarbons，TPHs)等有機污染物氧化過程中，能夠將長鏈烷烴降解成短鏈烷烴，并且不受土壤生物毒性影響，從而去除污染物。完全采用化學氧化修復成本高，且會對土壤造成二次污染。但是采用適量的化學氧化劑強化生物修復能克服上述單一修復技術的局限，有效提高修復效率[6-8]。
過硫酸鈉具有溶解度大、穩定性好、pH適應范圍廣以及修復后土壤微生物活性可恢復等優點，成為強化生物修復的主要化學氧化劑[9]。如羅俊鵬等[10]研究表明氧化劑強化生物修復能夠有效提高土壤中有機污染物的去除效率。本研究采用生物堆對江蘇油田某石油污染進行修復，修復后期采用過硫酸鈉對石油污染土壤進行氧化，研究其進一步強化生物修復的效果。并探究不同處理對TPHs的去除效果與微生物活性和群落結構變化的關系，為化學氧化強化生物修復石油污染土壤提供理論依據。
1材料與方法
1.1 儀器和試劑
儀器：GC-FID(Agilent 7890B，美國)，旋轉蒸發儀，酶標儀等。試劑：過硫酸鈉(Na2S2O8)為分析純;正己烷(nHexane，C6H14)、二氯甲烷(dichloromethane，CH2Cl2)均為色譜純;無水硫酸鈉(分析純，400℃活化6 h)、弗羅里硅土(60～100目，層析用;400℃活化6 h)。
1.2 供試土壤
石油污染土壤取自江蘇油田，TPHs含量為30649mg·kg–1，pH為8.01。
1.3 實驗設計
生物修復采用生物堆。生物堆反應器為160 L。堆肥處理中按油泥質量的12%添加豬糞，3%添加稻草秸稈。具體操作為在油泥中添加豬糞和稻草秸稈后充分攪拌均勻，堆肥桶外裹上保溫膜，底部接滲漏液出口管，加水調節堆體初始含水率為50%左右，定期翻堆通風與添加水分。將溫度計插入堆體中，每天記錄下溫度。為避免油泥中污染物分布不均勻，采取多點取樣混合法進行采樣，分別于堆肥的第0、40、80、120、160和240 d采樣。每次取樣50 g，將采集到的樣品凍干，研磨后過60目篩，使用GC-FID測TPHs含量，于第240 d檢測土壤中土壤微生物活性、群落結構與多樣性。處理如下：
(1)對照(Control)：70 kg油泥;(2)生物修復(NP，添加氮磷的生物修復處理)：70 kg油泥+8.4 kg豬糞+2.1 kg稻草;(3)氧化劑強化生物修復(NP_O，在NP基礎上氧化劑強化)：70 kg油泥+8.4 kg豬糞+2.1 kg稻草+氧化試劑。氧化劑于堆肥的第160 d加入50 mmol/kg 過硫酸鈉和 10 mmol/kg 硫酸亞鐵，充分攪拌均勻后取樣測TPHs濃度。
1.4 TPHs的提取及檢測
稱取凍干土樣(60目)2 g，以二氯甲烷作為萃取劑，采用索氏提取法于54℃水浴提取石油烴16～18 h。將提取液旋蒸濃縮后通過含有4 g弗羅里硅土和1 g無水硫酸鈉的玻璃砂芯層析柱凈化，用色譜純正己烷洗脫凈化的石油烴，將凈化的的洗脫液濃縮至2 mL后用GC-FID進行檢測，氣相色譜條件采用中華人民共和國國家環境保護標準《土壤和層積物石油烴(C10~C40)的測定氣相色譜法》(HJ 1021—2019)。
1.5 碳素利用法(Biolog法)分析微生物活性
本研究采用Biolog ECO板對各處理土壤的微生物群落代謝活性進行測定。稱取相當于5 g干土的新鮮土樣，于裝有50 mL 0.85%NaCl無菌溶液中，在30℃震蕩培養箱中以150 r·min–1的速度振蕩30 min，靜置15 min后，取上清液稀釋100倍。Biolog ECO板的每個孔中分別加入稀釋液150 μL，30℃培養箱中培養7 d，期間每24 h于酶標儀中采用590 nm測定吸光度。采用31個孔的吸光度平均值(average well color devel-opment，AWCD)來表征微生物的平均活性。
1.6 高通量測序
稱取新鮮土壤樣品0.5 g，采用土壤DNA提取試劑盒(Fast DNA® Spin Kit for Soil，MP Biomedicals，USA)，按照試劑盒中提供的說明書提取土壤DNA。將土壤DNA樣品送至中國上海美吉生物醫藥科技有限公司，由其采用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)對細菌的16S rRNA基因進行PCR擴增及產物純化，采用質量均一化后的PCR產物構建文庫并在Illumina-Miseq平臺上進行測序。測得的序列降噪后按照97%相似度進行運算分類單位(operationaltaxonomic units，OTU)劃分，采用SILVA數據庫對OTU的分類信息進行比對。
按照本研究樣本中最少序列數27876抽憑，然后采用抽憑后的數據計算微生物群落多樣性指數，包括Shannon、Chao、Invsimpson和ACE。采用主成分分析(principal componentanalysis，PCA)研究各處理間及各處理內細菌群落組成的相似性和差異性。采用LEfSe軟件進行線性判別分析(linear discriminant analysis, LDA)研究各處理中具有顯著富集的菌屬。
1.7 數據處理
采用R對數據進行方差分析及作圖，各個處理之間的差異采用鄧肯式多重方式比較(p<0.05)。
2結 果
2.1 土壤修復過程中TPHs的變化
生物堆修復能夠顯著降低土壤中TPHs含量。經過240 d的修復， NP和NP_O處理土壤中TPHs含量由30649mg·kg–1分別下降至5889mg·kg–1和2351mg·kg–1。全部達到工業用地標準4500mg·kg–1，并且在NP_O處理中，化學氧化能夠進一步強化土壤中TPHs的去除。
2.2 土壤修復過程中微生物活性與數量的變化
相較于對照組(Control)，生物修復處理組(NP、NP_O)顯著增強了微生物群落的代謝活性。并且，相較于NP處理組，氧化劑處理80 d(修復的第240 d)后， NP_O組中微生物代謝活性幾乎未受到氧化劑的影響。
2.3 土壤修復過程中細菌群落結構與多樣性的變化
2.3.1細菌群落多樣性變化
主坐標分析(principal coordinate analysis，PCoA)。各處理內細菌群落結構相似，各處理間細菌群落結構顯著分異�；瘜W氧化處理(NP_O)和未氧化處理組(Control和NP)分別位于PCoA1軸的負向和正向兩端;而生物堆處理組(NP、NP_O)和對照(Control)被PCoA2軸分開，分別位于正向端和負向端。各處理中土壤細菌多樣性指數。Alpha多樣性指數結果顯示，相較于對照處理(Control)，生物修復處理(NP、NP_O)顯著降低了土壤中細菌的多樣性，且采用化學氧化強化生物修復處理(NP_O)進一步降低了土壤中細菌多樣性。
2.3.2細菌群落分類
細菌群落門和屬水平上相對豐度結果�；瘜W氧化強化生物修復處理顯著降低了細菌群落在門水平上的多樣性。在修復各處理中，變形菌門的相對豐度最高，對照組(Control)、NP和NP_O中依次為68.35%、67.22%和76.35%，其中Gammaproteobacteria最為優勢，并且其相對豐度在生物修復的處理中顯著增加�；瘜W氧化強化生物修復提高了Bacteroidetes的相對豐度。
在屬水平上，采用熱圖和LEfSe分別分析了優勢屬和各處理中的標記屬。LEFse圖中由中心到外部的圓圈依次表示門、綱、目、科和屬的級別，圓點的大小代表微生物的相對豐度。紅色(Control)、青色(NP)、藍色(NP_O)圓點表示在其對應顏色的組別中的微生物標記物。結果表明，NP_O處理的主要相對豐度較高且細菌標記物是Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas、Porticoccaceae_C1.B045等。其中NP_O處理的Microbacterium(2.47%)、Paracoccus(2.98%)、Pseudomonas(3.51%)、Stenotrophomonas(11.98%)和Porticoccaceae_C1.B045 (2.64%)的相對豐度均高于其它處理組。
3討 論
微生物修復石油污染土壤費用較低且對環境友好，有利于可持續發展。然而，在生物修復的后期，石油污染物中的長鏈烷烴由于不易被微生物降解而殘留與土壤中，污染物降解過程中產生的有毒的中間產物會抑制微生物活性，導致生物修復后期降解效率下降，修復周期延長。研究表明，化學氧化能夠有效破壞長鏈烷烴并快速降解有機污染物及其中間產物，通過采用合適的氧化劑能夠使土壤微生物快速恢復活性，土壤TPHs含量顯著降低[11]。
本研究采用化學氧化強化石油污染土壤生物堆修復，分析修復過程的微生物群落結構變化以探究其修復效果與修復機制的研究結果表明，生物堆(NP、NP_O)修復240 d后，土壤中TPHs分別分為5889mg·kg–1和2351mg·kg–1，其中化學氧化強化生物修復后的土壤石油烴含量低于《土壤環境質量建設用地土壤污染風險管控標準(試行)》(GB 36600—2018)中的設定標準(4500mg·kg–1)。
為進一步揭示化學氧化強化生物修復相關機制，本研究發現，與NP相比， NP_O處理80 d后，土壤TPHs去除量進一步提高，但微生物代謝活性未呈現顯著差異。說明添加適量的氧化劑，土壤修復過程中微生物活性能夠得到快速恢復，并使石油烴得以快速去除。
這與Zhang等[12]報道的結果相一致。為了進一步探究細菌群落與石油烴降解的關系，本研究利用高通量測序對細菌群落結構和多樣性進行分析。PCA表明，影響群落結構變化的主控因素是化學氧化，產生的自由基具有強氧化性，甚至會造成細胞結構損壞導致微生物活性失效[13]，從而使微生物群落結構的豐富度減少，導致微生物群落的多樣性降低。門水平的微生物群落結構分析顯示，NP_O處理中放線菌門的相對豐度增降低，Bacteroidetes的相對豐度增加。
在門水平上，與對照相比，生物堆處理組(NP、NP_O)中Gammaproteobacteria相對豐度顯著增加，且該處理組石油烴去除率最高。已有研究表明，Gammaproteobacteria是石油污染土壤中降解石油烴的主要功能菌類群[14]。盡管生物堆修復處理組(NP、NP_O)降低了微生物群落的多樣性，但與污染物去除的優勢降解微生物群落多樣性無關，主要與土壤中相關功能菌的增殖有關，這與課題組前期的研究結果一致，即石油烴的去除與某種類型功能菌的富集有關[15]。
LDA分析結果發現，屬水平上，Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045是NP_O處理的主要細菌標記物;有研究表明Arthrobacter和Paenarthrobacter屬具有石油降解能力，如Bai等[16]研究證明Pseudomonas和Stenotrophomonas能有效降解烴類污染物。許殷瑞等[17]研究發現，throbacter是石油污染土壤中的主要嗜油屬。另外Hou等[15]的研究數據也證明，些菌屬是修復石油烴污染物的主要細菌類群。說明石油烴的降解與這2菌的富集有關。
4結 論
NP和NP_O處理使土壤中TPHs從30649mg·g–1分別下降至4389mg·g–1和1351mg·g–1，修復后的土壤石油烴濃度低于國家風險管制值(GB36600—2018)。BIOLOG ECO微孔分析和高通量測序結果進一步表明，氧化劑處理的土壤中微生物活性迅速恢復，且預氧化聯合生物刺激修復處理中Microbacterium、Paracoccus、Pseudomonas、Stenotrophomonas和Porticoccaceae_C1.B045作為主要細菌標記物，多數具有降解石油烴的能力。該結果顯示了化學氧化強化微生物修復的可行性，為未來石油烴污染土壤修復的實踐應用提供了理論依據。
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作者：許科偉1， 顧 磊1， 鄭旭瑩1， 王 彪2,3， 郭 鵬2,3
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